草酸青霉纤维寡糖转运蛋白研究

【摘要】资源日趋枯竭,环境污染和能源危机的日益加剧,使得寻找和开发可替代化石能源的新能源成为人类面临的亟待解决的问题。木质纤维素作为潜力巨大、环境友好型的可再生新能源可以有效地缓解能源和环境危机,保障人类社会的可持续发展。利用丝状真菌将木质纤维素水解糖化成为可发酵的单糖、寡糖等混合糖浆,进一步发酵为乙醇等清洁能源或其他高值生物化学产品是这些储量巨大的生物质资源的有效利用途径。目前,如何将生物质高效地水解为单糖和寡糖,并且高效的利用这些糖,已成为迫切需要解决的问题。对于木质纤维素降解真菌而言,纤维寡糖本身既是碳源,又是最可能的“真正诱导物”,与纤维素降解酶的诱导表达和各种糖利用息息相关,所以纤维寡糖转运蛋白的研究对进一步认识纤维素的降解利用及其信号转导机制具有重要意义。草酸青霉(Penicilliumoxalicum,原称为斜卧青霉,P.decumbens)114.2是本实验室从土壤中分离得到的一株生长快速的纤维素酶生产菌株,其基因组的测序工作已经完成,对其纤维素酶合成调控机制的研究也已取得一定的进展。目前,对于草酸青霉如何将纤维寡糖转运进入细胞,转运的过程如何受到细胞内外因素的调控,以及纤维寡糖转运蛋白在纤维素酶合成调控中的作用等方面的研究仍然非常薄弱。本论文在草酸青霉中发现了三个纤维寡糖转运蛋白,并揭示了其在纤维素降解利用和纤维素酶信号转导中不可或缺的作用。主要研究结果如下：1.鉴定出三种纤维寡糖转运蛋白通过生物信息学分析,在草酸青霉野生菌株114-2中预测了11个候选纤维寡糖转运蛋白,将其分别命名为CdtA.CdtB…CdtK.这些候选蛋白均属于主要协助转运蛋白超家族(MFS),且均在114-2基因组中被自动注释为乳糖透过酶。由于酿酒酵母在细胞膜上没有转运纤维寡糖的转运蛋白,在细胞内没有纤维寡糖的水解酶类,因此不能在纤维寡糖上生长。酿酒酵母的这种特征使纤维寡糖转运蛋白的功能鉴定成为可能。我们将上述候选转运蛋白基因分别在有粗糙脉孢菌胞内p-葡萄糖苷酶活性的重组酿酒酵母YGH1-1中进行异源表达,成功得到了9株纤维寡糖转运蛋白重组菌株,将其分别命名为YCdtB…YCdtK。其中只有重组菌株YCdtC,YCdtD和YcdtG可以在纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长,证实了转运蛋白CdtC,CdtD和CdtG具有纤维二糖的转运能力。进一步研究发现,CdtC、CdtD和CdtG可以转运聚合度比纤维二糖更高的纤维寡糖。通过对不同纤维寡糖转运蛋白和乳糖透过酶进行系统进化分析,发现纤维寡糖转运蛋白与乳糖透过酶在序列的系统进化上没有明显区分。2.发现三个纤维寡糖转运蛋白在草酸青霉中的表达模式不同研究了野生菌株114-2在不同碳源培养条件下三个纤维寡糖转运蛋白的转录水平,发现三个纤维寡糖转运蛋白具有不同的表达模式。其中cdtD基因的表达水平最高,cdtC基因的表达量次之,而cdtG在草酸青霉中的表达量较低。cdtC基因的表达较容易受到外界碳源的影响,其转录不仅受到葡萄糖和木糖的阻遏,还受到纤维素、纤维二糖和乳糖的诱导。cdtD基因的表达受葡萄糖的阻遏和纤维素的诱导。cdtG基因的表达水平最低,其表达只受葡萄糖和木糖的阻遏而不受纤维素等的诱导。这暗示了三种转运蛋白可能承担了不同的转运和调控功能。3.发现纤维寡糖转运蛋白在纤维素降解和纤维素酶合成调控中具有重要作用在草酸青霉中成功构建了纤维寡糖转运蛋白单缺失菌株。发现单缺失突变株在葡萄糖、纤维素、纤维二糖和木糖平板上的生长和表型都未受到影响,只是在纤维素诱导条件下对纤维二糖的利用能力稍有下降,而胞外蛋白的分泌能力及滤纸酶活、内切葡聚糖酶活、和p-葡萄糖苷酶活力均没有发生明显变化。对单缺失菌株中的纤维寡糖转运蛋白的表达水平进行检测,发现cdtC基因在ΔcdtD和ΔcdtG中的表达水平与野生菌株114-2相比明显上调。我们推测这是由于纤维寡糖转运蛋白功能上的互补造成的。因此,我们构建了纤维寡糖转运蛋白双缺失突变菌株。当纤维寡糖转运蛋白基因cdtC和cdtD同时被敲除后,突变株在葡萄糖、纤维素和纤维二糖平板上培养6天的菌落直径与野生菌株相比有所减小,且在纤维素平板上突变株不能产生透明水解圈。将预培养后的菌丝转接到纤维素液体培养基后,突变株几乎不能够生长。在纤维素诱导条件下,双敲除菌株ΔcdtDC对纤维二糖的利用能力与野生菌株相比显著降低。其胞外蛋白分泌量与野生菌株相比显著下降(约55%),半纤维素酶活力不足野生菌株的1/3,而纤维素酶活力几乎完全丧失。其主要纤维素酶基因cbhl(cel7A-2)和半纤维素酶基因xynl(xyn1OA)的表达量相对于野生菌株114-2显著下调(最大下调量为84%)。说明纤维寡糖转运蛋白在木质纤维素的降解利用和纤维素酶合成的信号诱导中的作用非常关键,而CdtC和CdtD在功能上存在一定的互补关系。在草酸青霉中还成功构建了CdtC、CdtD和CdtG的三缺失突变株,并对其在不同碳源上的表型进行了分析。研究表明,三缺失突变株与ΔcdtDC相比,在纤维素、纤维二糖和乳糖上的生长缺陷更加明显。4.发现涉及降解酶合成的转录因子不同程度地影响纤维寡糖转运蛋白的表达分析了转录因子AmyR、CreA和ClrB缺失菌株和纤维素酶高产菌株AcreAOclrB在纤维素培养条件下的表达谱数据。结果显示,敲除creA对cdtC和cdtD基因的转录影响不大：敲除amyR后cdtC和cdtD基因的转录水平上调；敲除clrB后cdtC基因不能表达,而cdtD基因的转录水平上调；敲除CreA同时过表达ClrB后cdtC和cdtD基因的转录水平上调；所有突变株中cdtG基因的转录水平均下调。这说明三个转运蛋白的作用和受调控的机制各不相同,cdtC基因主要受ClrB的直接调控；AmyR间接调控纤维寡糖转运蛋白的表达。5.发现过表达纤维寡糖转运蛋白能影响草酸青霉木质纤维素酶合成调控以野生菌株114-2为出发菌株,以?cbhl为启动子成功构建了纤维寡糖转运蛋白过表达菌株,发现在纤维素诱导条件下,转运蛋白的表达量与野生菌株相比均明显上调。其中过表达菌株OcdtG中cdtG基因的转录水平与出发菌株相比上调了1000倍以上,且除cdtG外,cdtC和cdtD基因的表达水平也显著上调。在纤维素诱导条件下,过表达菌株OcdtC、OcdtD和OcdtG的主要木质纤维素酶基因cbhl、egll(cel7B)和xynl的表达水平与野生菌株相比显著上调。其胞外外切纤维素酶活力和内切纤维素酶活力与出发菌株相比也有不同程度的提高。说明过表达纤维寡糖转运蛋白能够促进菌株对木质纤维素的降解利用,为进一步的分子改造以增强诱导物的形成具有重要意义。以缺失了胞内主要β-葡萄糖苷酶的突变菌株Δbgl2为出发菌株,以Pcbh1为启动子成功构建了纤维寡糖转运蛋白过表达菌株HcdtC和HcdtD。发现在纤维素诱导条件下,两株过表达菌株的纤维二糖转运能力及胞外木质纤维素酶活力与出发菌株相比没有明显变化。对其cdtC和cdtD基因的转录水平进行检测,发现其基因表达量与出发菌株相比明显上调。推测纤维素酶产量没有提高的原因可能是Abgl2中纤维寡糖转运蛋白数量已经饱和,或者用cbhl的启动子来启动纤维寡糖转运蛋白基因的表达可能会影响cbhl基因自身的转录,从而阻碍了木质纤维素酶活力的提高。6.发现纤维寡糖转运蛋白也能转运乳糖在获得纤维寡糖转运蛋白单、双缺失突变菌株的基础上,研究了其对乳糖的利用能力,发现纤维寡糖转运蛋白的缺失降低了菌株对乳糖的利用能力,尤其是cctC和cdtD基因双缺失菌株几乎不能在乳糖上生长,由此我们推测纤维寡糖转运蛋白可能具有转运乳糖的功能。在乳糖培养条件下对突变株胞外纤维素酶活力进行检测,发现单缺失菌株的胞外纤维素酶活力提高,而双缺失菌株的胞外纤维素酶活力下降甚至消失。对胞外蛋白进行SDS-PAGE分析发现淀粉酶含量明显增加。对单、双缺失菌株的胞外淀粉酶活力进行检测,发现除了AcdtG的淀粉酶活力与野生菌株相比变化不大外,其他菌株淀粉酶活力均显著提高。
【作者】李洁；
【导师】曲音波；
【作者基本信息】山东大学，微生物学，2014，博士
【关键词】纤维寡糖转运蛋白；纤维二糖；纤维素酶；草酸青霉；

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